Дельфис

Слова с приставкой «нанo», употребляемые с такими привычными понятиями, как технология, индустрия, производство, разработки, всё чаще входят в нашу повседневную жизнь. Становится популярной и производимая на основе нанотехнологий продукция с новыми невиданными свойствами. Сама приставка «нано» свидетельствует о том, что мы имеем дело с миллиардной долей единицы (10^-9), но чаще – с чрезвычайно малым количеством или размером вещества. Вместе с тем, внедрение и расширение нанотехнологий вызывает пристальный интерес биологов к возможной реакции живых организмов на появление в окружающей среде новых химических факторов, сопровождающих эти производства. Возрастающее внимание к ним обусловлено и поиском способов минимизации воздействий на окружающую среду. Последнее важно учитывать при совершенствовании природоохранной тактики. Суть последней заключается в уменьшении вредных воздействий на живые организмы. При этом загрязнения могут быть даже в незначительных (сверхмалых) количествах. Под сверхмалыми дозами веществ (нанодозами – НД) понимают концентрацию до 10^-17 моля° (М) [1]. Несмотря на их почти фантомную величину, получены достоверные эффекты воздействий некоторых веществ в НД на различные биологические объекты [2], что позволяет обнаружить в том некоторые общие закономерности [3]. Они проявляются в характере дозовой зависимости (би- или полимодальный) там, где нет никакого эффекта: вначале наблюдается эффект, затем он исчезает в области 10^-12–10^-8   М   .Далее, при уменьшении концентрации вещества эффект вновь появляется, однако, как правило – противоположного знака. Возможно, в характере этой зависимости заложен принцип надёжности биологической организации – её ответ на вещества, присутствующие в окружающей среде, что отражает ритмичность гомеостаза.

Обнаружено также, что живые организмы отвечают диаметрально противоположным образом на большие и малые дозы воздействий. (Для этого явления был предложен термин «гормезис».)

Парадоксальным эффектом НД является и то, что биологическая система может «почувствовать» влияние фактора, введённого в неё извне, в концентрации на несколько порядков ниже тех, которые имеются в самой системе (органе, организме и т.п.) [5]. Найдено, что в тканях и органах содержится в среднем от 10^-8 до 10^-11 М гормонов, нейромедиаторов, нейропептидов и других биологически активных веществ. Вместе с тем показана способность клеток и тканей реагировать на воздействия в концентрации меньше 10-17 М [6].

Одними из биогенных веществ, проявляющих свой эффект в малых дозах, являются биологически активные соединения – феромоны, их образно называют «гормонами среды». Эти соединения выделяются растениями и животными в окружающую среду и влияют на поведение или физиологическое состояние других особей только своего вида. Это свойство феромонов называется «видоспецифичностью». Особенно полно изучена и широко известна роль феромонов в жизни насекомых. В последнее время интенсивно исследуются и получают практическое применение феромоны сельскохозяйственных животных и даже человека. Значительно меньше изучены феромоны у водных животных. Несмотря на различия воздушной и водной сред, у феромонов водных и наземных организмов много общего. Так, феромон тревоги карпа эффективен только у карповых рыб и у близких в систематическом отношении «родственников»; найдена его поведенческая активность в малых дозах (в частности, этот феромон действует до концентрации 10^-8). Важно отметить, что феромон тревоги вызывает у карповых состояние стресса и сопутствующие этому синдрому биохимические сдвиги. Опираясь на упомянутую выше концепцию гормезиса, логично предположить, что более низкие концентрации феромона тревоги – его НД – могут корректировать развитие синдрома тревоги (стресса) [7].

В настоящей работе представлены полученные авторами экспериментальные результаты по выявлению эффекта нанодоз феромона тревоги карповых рыб на физиологический статус водных организмов, а также сделана попытка обсуждения роли НД биологически активного вещества в водоёме. Эксперименты проводили на двух группах водных организмов: простейших одноклеточных – инфузориях спиростомах (Spirostomum ambiquum Ehrbg.), а также низших позвоночных – рыбах. Используемый в экспериментах в НД (1х10^-15) феромон тревоги, изготовлен по авторской технологии, запатентован и получил название «циприн» [8].

Среди «ответных» реакций животных на внешние воздействия поведение относится к наиболее чувствительным феноменам. Важнейшим показателем функционального состояния одноклеточных является двигательная активность. По изменению поведения у этих животных судили о характере воздействия и его величине. Количественным показателем поведения выбрана спонтанная двигательная активность, выраженная в относительных единицах [9]. Ранее, в опытах на спиростомах, нами было показано, что фенозан (синтетический препарат, блокирующий работу одной из ферментных систем) в концентрациях до 10^-25 М в полтора раза повышает двигательную активность одноклеточных [4]. В проведённом нами исследовании [10] установлено, что спиростома воспринимает феромон тревоги рыб. Однако концентрация его (1х10^-5) в тех экспериментах на 10 порядков больше используемой в настоящей работе. Для выявления эффективности более низких концентраций использовали серию разведений, приготовленных с применением гомеопатической технологии. На рис.1 представлены средние данные из 10 опытов. Наглядно показан стабильный дифференцированный поведенческий ответ спиростом на спектр концентраций (1х10^-5; 1х10^-10; 1х10^-15 – циприн; 1х10^-20; 1х10^-25; 1х10^-30) исследованных концентраций. На рис.1 ясно виден нелинейный ритмический характер зависимости. Показано, что величина эффекта от величины НД феромона колеблется от максимального (в точках №№1, 3, 5) до минимального (в точках №№2, 4, 6). Представленными здесь экспериментами подтверждается принципиальное сходство характера воздействия биологически активного вещества в НД с показанными ранее эффектами других соединений в НД [3]. Результаты представленных в настоящем сообщении исследований доказывают, что изучаемые нами водные одноклеточные дифференцированно воспринимают концентрацию НД. Исследования влияния НД на базисные универсальные формы поведения у организмов, даже стоящих на низкой ступени эволюционного развития, представляют несомненный интерес, поскольку позволяют рассматривать поведение как один из древних факторов, регулирующих состояние биоценоза и характеризующих его свойства. Обнаружение эффекта НД у водного одноклеточного имеет и практическое значение. Разработанные и применяемые авторами высокочувствительные функциональные методы оценки двигательной активности инфузорий свидетельствуют, что спиростома – хороший тест-объект при изучении воздействия НД.

^{Рис.1. Влияние спектра разведений феромона тревоги рыб на спонтанную двигательную активность (СДА) инфузории спиростомы}

Ранее нами получены убедительные данные для микроорганизмов. Установлена стимуляция роста колоний Escherichia coli при обработке их НД феромона. По тесту КОЕ (колоний образующая единица) количество колоний бактерий при добавлении в среду НД увеличилось на 37% . Достоверное возрастание количества колоний указывает на способность НД феромона стимулировать жизнедеятельность клеток. Исследовали и эффект НД феромона на изменение скорости эмбрионального развития икры рыб. Найдено, что НД феромона повышают выживаемость больше, чем в два раза. Достоверно увеличивается и скорость развития икры [11]. Из приведённого экспериментального материала следует, что все испытанные нами одноклеточные водные организмы воспринимают воздействие НД феромона. Вместе с тем выявленную нами активность можно рассматривать как эффективность НД на уровне организма (одноклеточного) и на уровне клетки. Следует подчеркнуть, что нанодозы феромона изменяют знаковые для жизнедеятельности изучаемых организмов критерии.

Для сравнительной оценки эффекта НД феромона у высоко организованых водных позвоночных эксперименты проводили на нескольких видах рыб (карп, толстолобик, осётр, тиляпия и форель). Их выбор обусловлен принадлежностью к далёким в систематическом отношении семействам. Ранее у рыб были показаны нарушения в обмене веществ, вызванные состоянием тревоги (стресса), которые сопровождаются сдвигами биохимических параметров. Первая серия опытов (табл.1) проводилась для изучения изменений при кратковременном, остром стрессе и попытках его нормализации НД феромона. Острый стресс вызывали перевозкой и низкой концентрацией кислорода в воде, где находились рыбы. Об изменениях физиологического статуса судили по сдвигам биохимического состава специфической жидкости – наружной слизи рыб [12]. Наиболее информативным и специфическим критерием стресса у рыб служит появление гемоглобина в их наружной слизи. Представленные в таблице 1 результаты свидетельствуют о значительных изменениях при остром стрессе у всех видов исследованных рыб; видно увеличение содержание гемоглобина и белка, а также изменение рН и плотности слизи; отмечены и сдвиги в формуле крови. В ходе эксперимента найдено, что воздействие НД феромона оказывает антистрессовое воздействие на рыб. Добавление препарата в воду к стрессированным рыбам практически нормализовало сдвиги от стресса по исследуемым биохимическим показателям слизи и крови (см. табл.1). При этих условиях у стрессированных рыб нормализуется и содержание общего белка в ткани мозга, сниженное при стрессе. Следует обратить внимание на то, что возвращение к норме изучаемых параметров выявлено у всех видов исследованных рыб, даже относящихся к далёким в систематическом отношении группам; значением рН найденные эффекты отличались только по величине, а не по его направленности.

^{Таблица 1. Биохимические показатели слизи и кровы рыб при стрессе и действии НД антистрессора. Для удобства сравнение эффекта по четырём различным параметрам, полученные экспериментальные данные представлены в процентах}

Во второй серии опытов стрессировали рыб длительным содержанием в водоёме с некомфортным. Хроническое стрессирование вызывает глубокоразвитый стресс, который сопровождается более значительной величиной сдвигов изучаемых параметров. Действительно, удалось показать, что при хроническом стрессе количество гемоглобина в слизи увеличивалось в 6,5 раз. НД феромона лишь частично снижают это повышение, однако, полной нормализации не наступает. Вместе с тем репарация происходит практически на 70 % (см. табл.1). Вероятно, величина постстрессовых репараций после обработки НД феромона несколько варьируется, находясь в зависимости как от времени обработки препаратом, так и от глубины развития стресса. В результате проведённой работы можно сделать и «побочный» практический вывод: для достижения максимального эффекта НД необходимо подбирать время воздействия препарата и соотносить его со временем начала стресса.

Представляло несомненный интерес испытать воздействие НД феромона на тканевом и клеточном уровнях у рыб. Ранее было показано, что НД некоторых физических и химических воздействий изменяют активность одного из ключевых ферментов стресса – ацетилхолинэстеразы (АХЭ) – при исследовании как на уровне целого организма (in vivo), так и на фракцию мембран и очищенный фермент (in vitro) [13]. С целью выявить корреляцию изменений при обработке НД феромона целого организма с изменениями в его тканях и клетках мог оценивали активность и некоторые характеристики АХЭ в мозге рыб. В последующих экспериментах удалось показать, что при развитии стресса у рыб (опыты in vivo) снижается активность и изменяются кинетические характеристики АХЭ (рис.2а). Добавление НД феромона в воду к стрессированым рыбам нормализует кинетические характеристики АХЭ. При проведении эксперимента «в пробирке» in vitro (добавление НД феромона к гомогенату головного мозга стрессированного карпа) также обнаружены изменения исследованных параметров. Однако требуется особо подчеркнуть, что направленность изменений была противоположной (рис.2б). Подобный эксперимент с фракцией мембран головного мозга стрессированной рыбой тилапией выявляет аналогичный эффект (рис.2б). Добавление НД феромона к очищенному препарату АХЭ из эритроцитов крови человека не оказывает заметного действия на активность фермента вне зависимости от разведения добавляемого препарата и не меняет кинетических характеристик фермента. Исследования, проведённые на водных позвоночных, позволили выявить и сопоставить эффект НД феромона у одного животного на разных уровнях биологической организации. При стрессе у рыб обнаружены изменения биохимических параметров в слизи и крови, а также изменения свойств и кинетических характеристик АХЭ мозга – одного из ферментов стресса. Выявлен нормализующий антистрессовый эффект НД феромона на эти параметры. При исследовании эффекта НД феромона in vitro показано, что добавление его к тканям и органеллам мозга также вызывает значительные сдвиги активности АХЭ. Однако эти изменения противоположного знака и приводят к ещё большему снижению, а не нормализации изучаемых параметров.

^{Рис.2а. Влияние НД феромона на скорость реакции и кинетические характеристики АХЭ (в экспериментах in vivo)}

^{Рис. 2б. Влияние НД феромона на скорость реакции и кинетические характеристики АХЭ (в экспериментах in vivo)}

Опираясь на полученные экспериментальные данные, можно сделать следующие выводы. Для обнаружения эффектов НД могут быть использованы в виде биотестов различные исследованные нами живые организмы. Бактерии (рост и размножение – по показателю КОЕ), простейшие (поведение – двигательная активность), икра рыб (выживаемость и скорость развития), различные виды рыб (прижизненно – биохимический состав наружной слизи и метаболические критерии в тканях, клетках и их органеллах). Выявленное влияние НД на многие характеристики живого (рост, размножение, физиологический статус), на различные фазы жизненного цикла (эмбрионального развития и взрослого организма) и функции (поведение и движение) позволяет судить о значении НД у водных организмов. Исследования на организменном и тканевом уровне подтвердили необходимость учитывать эффект при выборе минимально допустимой концентрации и охране экосистем от антропогенного воздействия. Дальнейшее изучение функционального состояния гидробионтов под влиянием НД различных веществ позволит более полно охарактеризовать экологическую ситуацию в водоёме. Природные воды могут интегрировано, отражая состав и воздуха и почвы, служить критерием состояния окружающей среды. Моделирование ситуации в гидросфере позволит прогнозировать повреждающее воздействие токсикантов в НД на водные организмы. Принятая тактика исследования качества окружающей среды может быть использована для оценки состояния среды, изменённой различными факторами, включая НД.

Суммируя полученные нами и представленные в этой статье результаты, представляется уместным сделать основной вывод: биологически активное вещество феромон тревоги рыб, находящееся в водоёме в НД, оказывается эффективным у водных обитателей. Особо хотелось подчеркнуть, что активность НД проявляется в эксперименте на биологических системах разного уровня организации, от макромолекул, клеток, органов и тканей до целых организмов.

В общебиологическом и эволюционном смысле важно, что этот эффект был обнаружен и исследован как у водных беспозвоночных (инфузорий спиростом), так и у некоторых видов рыб. Выявленные нами факты хорошо согласуются с установленными известными закономерностями действия НД:

1. Би- или полимодальный характер зависимости от нанодоз обнаружен и у спиростомы при тестировании ряда разведений феромона (рис.2).

2. При уменьшении концентрации до НД феромон тревоги проявил эффект противоположного знака у рыб. НД феромона нормализуют стрессовые изменения, обнаруживая новые антистрессовые свойства.

3. У НД феромона исчезло такое важное присущее феромону свойство, как видоспецифичность. Напомним, что феромон тревоги вызывает стресс в больших дозах только у карпа и его ближайших родственников. Однако его НД проявляют антистрессовую активность у рыб, далёких от карпа в систематическом отношении (лососевые, осетровые и окунёвые). Видоспецифичности эффекта не найдено и на клеточном уровне. Синдром стресса отсутствует у клеток a priori. Однако эффект НД прослеживается на различных клетках и заключается в изменении знаковых для их жизнедеятельности критериях. Так, у одноклеточной спиростомы НД изменяет двигательную активность. В ткани мозга рыб у клеток и её органелл НД приводит к сдвигам АХЭ и её характеристик. Получение эффекта от применяемых веществ в концентрациях, сниженных от привычных нам на несколько порядков, позволяет уменьшить и сопутствующее эффекту, возможно, «вредное», с биологической точки зрения, видоспецифическое влияние. Обнаруженная утрата видоспецифичности эффекта у биологически активного вещества представляет, с нашей точки зрения, особый интерес, поскольку может являться одним из проявлений универсальной роли НД. При действии НД на клетку, ткань или многоклеточный организм эффект возникает во всех структурах и затрагивает многие характеристики биоты. В итоге расширяется представление об универсальности эффекта НД на животных.

В целом, эволюционная стабильность (универсальная для всего живого) функционального значения НД может служить примером энергетически экономного пути развития. Его суть состоит в сформированном в процессе эволюции механизме защиты природы от «лишних» сильных воздействий среды, приводящих к значительным скачкам гомеостаза. Следует ещё раз подчеркнуть, что эффект нанодоз специфического биогенного вещества феромона тревоги выявлен у эволюционно далёких представителей водной фауны – беспозвоночных и позвоночных животных. Одной из гипотез, которая может объяснить однотипность влияния НД на растительные и животные организмы, включая человека, может быть общность молекулярных механизмов, определяющих ответные реакции на эти дозы.

Говоря о перспективах дальнейшего расширения изучения биологического аспекта НД, отметим необходимость продолжения и развития экологических исследований, используя получаемые современные данные. В частности, водная среда, являющаяся «родным домом» для водных животных, характеризуется не только температурой, солёностью, Рн и прочими несомненно существенными параметрами, которые необходимо учитывать при экологических исследованиях. Крайне нужен для экологии водоёма и набор биогенных соединений, выделяемых его обитателями. В этом космосе для водных организмов биогенные соединения, особенно с информативными свойствами, могут играть важную, по большей части не установленную ещё роль. Причём значимость этой роли не определяется высокими концентрациями присутствующих соединений. Кроме того необходимо принимать во внимание и относительно недавно полученные данные о неизвестных ранее свойствах воды, которые изменяют и дополняют прежние представления о воде как универсальном растворителе, в котором находятся различные химические и биогенные вещества.

В ряде лабораторий активно исследуется в последнее время структурированность воды (водные молекулы образуют двухфазные и многофазные системы, в которых между фазами создаются скачки электрических потенциалов, обусловленных различием активности электронов). По мнению разных авторов, это крайне важно для решения проблемы информационного взаимодействия в водной среде. Следует отметить и довольно часто упоминаемую теперь «память» воды. Это сохраняющееся или, точнее, медленно релаксирующее и поэтому считающееся устойчивым образование из структурных элементов воды, подвергнутой воздействию внешних факторов. Вероятно, как считают некоторые учёные, расшифровка структуры воды (её энергетического состояния), молекул воды и раскрытие механизма образования стабильных структурных элементов должно содержать в себе объяснение столь необычному и трудно воспринимаемому явлению – сохранению информации, что и связано с малоизученной ролью растворённых в воде различных химических соединений в НД. «Тот, кто научится управлять состоянием водной среды – научится управлять состоянием нашего организма», – писал лауреат Нобелевской премии Альберт Сент Дьёрди. Авторы не являются специалистами в этой области и не претендуют на объяснение явлений, связанных с вышеперечисленными фактами, не вошедшими в круг научных интересов биологов. Авторы полагают, что следует привлечь внимание особенно «водных биологов» к вновь открытым свойствам воды в связи с её возможным влиянием  на живые организмы.

Итак, биологический смысл влияния нанодоз состоит в задействованном природой механизме самозащиты. И здесь срабатывает эффект минимизации энергетических затрат, обусловленный возможностью адекватно/адаптивно реагировать на разные воздействия нанодоз.

Н.Е. Лебедева, кандидат биологических наук; Н.А. Тушмалова, доктор биологических наук

lebedeva1502@yandex.ru